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IPEN-DOC 13223
- OLIVEIRA, TAIS L. de
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Desenvolvimento de processo de fermentacao em biorreator para producao de prolactina humana secretada no espaco periplasmico de Escherichia coli
/ Development of the fermentation process in bioreactor for the production of human prolactin secreted in the periplasmic space of Escherichia coli
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2008.
Dissertacao (Mestrado) -
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP,
Sao Paulo.
61 p.
Orientador: Carlos Roberto Jorge Eduardo.
DOI:
10.11606/D.85.2008.tde-07072009-152955
Abstract: A Prolactina (PRL) é um dos hormônios mais versáteis em termos de ação biológica. Sua ação mais conhecida está relacionada com o estímulo da lactação e regulação do crescimento e da diferenciação da glândula mamária; também apresenta importante aplicação diagnóstica. Somando os crescentes estudos sobre suas possíveis aplicações terapêuticas, fica cada vez mais notória a necessidade da obtenção desse hormônio puro, biologicamente ativo e na sua forma autêntica.O objetivo fundamental desse projeto foi a produção de hPRL em escala laboratorial a partir de bactérias (E.coli) modificadas geneticamente, utilizando um sistema de expressão baseado no promotor Lambda () PL, o mesmo utilizado com sucesso em nosso laboratório na expressão do hGH. Descrevemos nesse trabalho um processo de cultivo em biorreator, onde não foi utilizado o repressor cIts, uma proteína termo-sensível que usualmente é utilizada para inibir o funcionamento do promotor PL durante crescimento a 30ºC. O processo de cultivo apresenta basicamente três etapas: na primeira etapa o crescimento é realizado sem adição contínua de nutrientes (cultivo em batch), na segunda etapa ocorre adição contínua de nutrientes e carboidrato (cultivo em fed-batch) e na última etapa é realizada a ativação, caracterizada pelo aumento da temperatura mantendo-se a adição de nutrientes e carboidrato. Esse processo de fermentação rápido e flexível, com duração média de 20 horas, permitiu obter uma biomassa final correspondente à densidade óptica de aproximadamente 30 A600nm (unidades ópticas de absorbância em 600nm) e com uma expressão da ordem de 1g de hPRL mL-1 A600 -1, as mais altas já relatadas para secreção de prolactina no espaço periplásmico. A hPRL monomérica foi purificada e caracterizada por métodos físico-químicos e biológicos, os quais confirmaram a sua atividade biológica e imunológica, o seu correto processamento e uma massa molecular relativa (Mr) de 22.906.
Palavras-Chave: lth; escherichia coli; bioreactors; fermentation
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IPEN-DOC 14191
- BALDUINO, KELI N.
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Renaturacao em altas pressoes hidrostaticas de proteinas recombinantes agregadas em corpos de inclusao produzidos em Eschirichia coli
/ Refolding in high hydrostatic pressure of recombinant proteins from inclusion bodies in Escherichia Coli
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2009.
Dissertacao (Mestrado) -
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP,
Sao Paulo.
68 p.
Orientador: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias.
DOI:
10.11606/D.85.2009.tde-19112009-095254
Abstract: A expressão de proteínas na forma de corpos de inclusão em bactérias é uma alternativa muito interessante para obtenção de proteínas recombinantes. No entanto, a agregação é uma dificuldade frequentemente encontrada durante a renaturação dessas proteínas. Altas pressões hidrostáticas são capazes de solubilizar os corpos de inclusão na presença de baixas concentrações de reagentes desnaturantes, favorecendo a renaturação protéica com alto rendimento e redução de custos. O presente trabalho tem como objetivo a renaturação de proteínas recombinantes expressas em Escherichia coli sob a forma de corpos de inclusão usando altas pressões hidrostáticas. Três toxinas, todas apresentando cinco ou mais pontes dissulfídicas foram estudadas: NXH8, Naterina 2 e Bothropstoxina 1. Suspensões dos corpos de inclusão das três proteínas foram pressurizadas em 2000 bares de pressão durante 16 horas. Os tampões de renaturação foram otimizados para as três proteínas. O tampão utilizado no processo de renaturação da NXH8 foi Tris HCl 50 mM, pH 9,0 com proporção de 1GSH:4GSSG em concentração de 6 mM e 2 M GdnHCl. Foram utilizados corpos de inclusão em D.O.(A600nm) de 0,5. Após o processo de renaturação foi realizada diálise em pH 7,0. O rendimento final de recuperação de NXH8 solúvel foi de 40%, sendo obtidos 28,6 mg/L de meio de cultura. A renaturação de Bothropstoxina 1 foi obtida em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM pH 7,5 na proporção de 2 GSH:3 GSSG em concentração de 3 mM e 1 M GdnHCl. Utilizamos uma suspensão com D.O.(A600nm) de 0,5. O rendimento final de recuperação de Bothropstoxina 1 renaturada foi de 32 %, obtendo-se 9,2 mg/L de meio de cultura. A renaturação de Naterina 2 foi obtida em tampão de renaturação com 20 mM de Tris HCl pH 9,0 na proporção de 2 GSH:3 GSSG e concentração de 10 mM e 1 M GdnHCl e corpos de inclusão na D.O. (A600nm) de 6,0. Foram obtidas 3,7 mg de Nateria 2 renaturada /L de meio de cultura (20% de recuperação a partir dos corpos de inclusão). O rendimento da Naterina 2 renaturada foi de 20 %. Para a análise e a comprovação da eficácia do processo de renaturação sob pressão foram utilizadas as técnicas de SDS-PAGE, western blot, microscopia eletrônica de varredura, ensaios biológicos in vivo e in vitro e estruturais. As análises físicoquímicas realizadas em NXH8 não mostraram nenhuma comprovação da sua renaturação. O ensaio in vivo realizado com a Naterina 2 mostrou uma leve atividade de contração de vênulas, indicando que ela esteja em sua conformação correta. Os ensaios in vitro com a Bothropstoxina 1 mostraram uma atividade citotóxica dose-dependente em células musculares.
Palavras-Chave: proteins; bacteria; escherichia coli; hydrostatics; pressurization; inclusions; agglomeration; spectroscopy
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IPEN-DOC 06917
- AFFONSO, REGINA
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Estudo da expressao citoplasmica bacteriana de uma forma de prolactina humana e de sua solubilizacao e renaturacao a partir de corpos de inclusao.
2000.
Tese (Doutoramento) -
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP,
Sao Paulo.
105 p.
Orientador: Paolo Bartolini.
Palavras-Chave: lth; escherichia coli; cytoplasm; bacteriophages; recombinant dna; separation processes; solubility; purification; hormones; genes; bacteria
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IPEN-DOC 08712
- VIANNA, ELIZABETH K.G.
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Padronizacao de um metodo de HPLC em fase reversa para determinacao de prolactina em extratos bacteriano e em sua forma purificada: sua aplicacao em estudo colaborativo internacional promovido pela O.M.S.
2002.
Tese (Doutoramento) -
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP,
Sao Paulo.
58 p.
Orientador: Paolo Bartolini.
Palavras-Chave: lth; purification; escherichia coli; high-performance liquid chromatography; accuracy
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IPEN-DOC 12235
- YONAMINE, CAMILA M.
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Clonagem de serino proteases do veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus e expressão da giroxina em célula de mamífero.
2007.
Dissertação (Mestrado) -
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP,
Sao Paulo.
170 p.
Orientador: Maria Aparecida Pires Camillo.
DOI:
10.11606/D.85.2007.tde-16052012-081641
Abstract: As serino proteases participam de diversos processos fisiológicos (tal como o de coagulação) e patológicos. Essas enzimas estão amplamente distribuídas entre as espécies, são também toxinas dos venenos de serpentes, sendo denominadas SVSPs (snake venom serine proteases). Essas SVSPs são multifuncionais e contêm uma tríade catalítica formada pelos aminoácidos HDS. Algumas SVSPs são comercialmente disponíveis, sendo indicadas para o tratamento de infarto do miocárdio, tromboses e embolia pulmonar. No veneno de Crotalus durissus terrificus estão descritas até o momento, apenas duas SVSPs sendo que a mais estudada é a giroxina que representa cerca de 2,5% do veneno total. No presente estudo foi reportado a clonagem de sete serino proteases amplificadas a partir de uma biblioteca de cDNA de glândula de veneno de um único espécime adulto de Crotalus durissus terrificus. Estes clones foram analisados com relação à organização do cDNA, estrutura e prováveis funções. A construção do modelo tridimensional da giroxina permitiu verificar as similaridades com tripsina, trombina e outras SVSPs. A glicosilação e a presença de muitas pontes dissulfetos dificultam a obtenção das SVSP recombinantes na forma solúvel e com atividade, por expressão em E.coli. Assim, neste trabalho foi abordada a expressão em células de mamífero (que realiza as modificações pós-traducionais) com resultados promissores. Para tanto, o peptídeo sinal de Igk, a seqüência madura e a região 3 UTR da giroxina foram clonados no vetor pED, originando um novo vetor (pED-Giro). Este vetor carrega o peptídeo sinal de Igk, o que possibilitou a secreção da giroxina para o meio de cultura. O vetor pED-Giro foi transfectado em células CHO DXB11 dhfr e COS-7. A giroxina foi detectada no extrato total das células COS-7 por western blot e, em seguida, purificada do meio de cultura com coluna de afinidade (Benzamidina Sepharose) e demonstrado sua integridade pelo ensaio de atividade esterásica.
Palavras-Chave: snakes; venoms; enzymes; serine proteinases; cloning; trypsin; thrombin; escherichia coli; animal cells; mammary glands
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IPEN-DOC 11794
- NUNEZ, SILVIA C.
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Estudo da dinâmica de fotodegradação e agregação das fenotiazinas azul de metileno e azul de orto-toluidina com relação a eficiência fotodinâmica.
2007.
Tese (Doutoramento) -
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP,
São Paulo.
Orientador: Martha Simoes Ribeiro.
DOI:
10.11606/T.85.2007.tde-29112007-172514
Abstract: A terapia fotodinâmica apresenta-se como uma possível alternativa terapêutica para o tratamento de infecções localizadas, porém, para sua aplicação clínica, as variáveis relacionadas à eficiência fotodinâmica devem ser analisadas para a obtenção de resultados satisfatórios. Os objetivos deste trabalho foram investigar a dinâmica de agregação dos fotossensibilizadores azul de metileno e azul de orto-toluidina em diferentes solventes, caracterizar os solventes em relação ao oxigênio molecular disponível em cada solução e seu respectivo pH, observar o efeito da temperatura, sangue e saliva na agregação dos fotossensibilizadores, monitorar a dinâmica de fotodegradação em função da exposição radiante e irradiância, avaliar a eficiência fotodinâmica microbiologicamente e através da produção de 1O2. Os solventes utilizados foram água deionizada, água destilada, água estéril, solução salina 0,9% e solução salina 0,45%. Em cada uma das soluções, foi realizado teste de pH e medição de oxigênio dissolvido por sonda apropriada. Os efeitos de fluidos, temperatura e concentração na agregação dos fotossensibilizadores foram analisados através de espectroscopia de absorção óptica. A dinâmica de fotodegradação foi testada com diferentes exposições radiantes e irradiâncias, nos comprimentos de onda adequados para cada composto. As irradiações foram realizadas com emissão de banda larga e banda estreita. A eficiência fotodinâmica foi avaliada através da medição direta da luminescência do oxigênio singleto em ?=1270nm, em dois solventes. Testes microbiológicos foram realizados com culturas de Escherichia coli. Os resultados obtidos demonstram que a dinâmica de agregação está diretamente relacionada com solvente e concentração: a solução salina apresentou diferença em relação aos demais solventes em todos os quesitos analisados. Dos solventes testados, a água deionizada apresentou os melhores resultados. A dinâmica de fotodegradação está relacionada, em sua magnitude, com a exposição radiante e, em sua dinâmica, com a irradiância. O uso de banda larga para irradiação foi mais efetivo para na fotossensibilização letal. Portanto, para a aplicação clínica da terapia, o substrato deve ser considerado. Apropriadas condições de irradiação, solvente e concentração de fotossensibilizador aumentam a eficiência do processo.
Palavras-Chave: therapy; methylene blue; toluidine blue; solvents; photosensitivity; absorption spectra; spectroscopy; phenothiazines; escherichia coli; lasers
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IPEN-DOC 06652
- OLIVEIRA, JOAO E. de
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Purificacao de hormonio de crescimento humano recombinante obtido no espaco periplasmico de ESCHERICHIA COLI, visando sua aplicacao clinica.
1999.
Dissertacao (Mestrado) -
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP,
Sao Paulo.
69 p.
Orientador: Maria Teresa de Carvalho Pinto Ribela.
Palavras-Chave: sth; purification; yields; escherichia coli; precipitation; ion exchange chromatography; liquid column chromatography; radioimmunoassay; accuracy; proteins
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IPEN-DOC 18596
- RODRIGUES, DANIELLA
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Utilização de altas pressões hidrostáticas para o estudo e renaturação de proteínas com estrutura quaternária
/ Utilization of high hydrostatic pressure for the study and refolding of proteins with quaternary structure
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2012.
Dissertação (Mestrado) -
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP,
São Paulo.
106 p.
Orientador: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias.
DOI:
10.11606/D.85.2012.tde-06032013-144803
Abstract: A produção de proteínas recombinantes é uma ferramenta essencial para a indústria biotecnológica e suporta a expansão da pesquisa biológica moderna. Uma variedade de hospedeiros pode ser utilizada para produzir estas proteínas e dentre eles, as bactérias E. coli são as hospedeiras mais utilizadas. No entanto, a expressão heteróloga de genes em E. coli frequentemente resulta em um processo de enovelamento incompleto que leva ao acúmulo de agregados insolúveis, conhecidos como corpos de inclusão (CI). Altas pressões hidrostáticas são capazes de desfavorecer interações intermoleculares hidrofóbicas e eletrostáticas, levando à dissociação dos agregados e por isso são úteis para solubilizar e renaturar proteínas agregadas em CI. O presente trabalho teve como objetivo o estudo do processo de desagregação dos CI e de renaturação das proteínas oligoméricas subunidade B da toxina colérica (CTB) e região globular da fibra adenoviral (RGFA) utilizando altas pressões hidrostáticas. A toxina colérica (CT) é composta por uma subunidade A e cinco subunidades B combinadas em uma holotoxina AB5. A CTB é a porção pentamérica não tóxica da CT, responsável pela ligação da holotoxina ao receptor gangliosídeo GM1. A fibra do adenovírus é uma proteína homotrimérica que forma parte do capsídeo viral, organizada em três regiões: a cauda N-terminal, a haste central e a região C-terminal (região globular). A RGFA se liga à proteína de membrana CAR nas células hospedeiras e promove a internalização do vírus. Os estudos apresentados neste trabalho demonstraram que a alta pressão hidrostática foi eficaz na desagregação dos CI da CTB e da RGFA. As condições de renaturação foram otimizadas utilizando-se diferentes proporções do par redox glutationa oxidada e reduzida, concentrações de agentes caotrópicos, presença de aditivos e esquemas diferenciados de compressão/descompressão daqueles previamente descritos na literatura. CTB solúvel e pentamérica foi obtida pela compressão da suspensão de CI a 2,4 kbar por 16 horas em tampão TrisHCl 50 mM pH 8,5, 1 mM de tween 20 e descompressão direta seguida de incubação em pressão atmosférica. O rendimento de renaturação da CTB solúvel e pentamérica foi de até 45 % e 288 mg de CTB/litro de cultura bacteriana. Esta proteína apresentou estrutura regular e atividade biológica. RGFA trimérica foi obtida pela compressão da suspensão de CI em tampão TrisHCl 50 mM pH 8,0 e 0,5 M de L-arginina a 2,4 kbar por 1,5 horas e 0,4 kbar por 16 horas antes da completa descompressão. O rendimento de proteína solúvel trimérica da RGFA foi de 4 %, porém não foi possível obter a atividade biológica desta proteína.
Palavras-Chave: proteins; bacteria; escherichia coli; inclusions; hydrostatics; pressurization
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IPEN-DOC 06046
- SOARES, CARLOS R.J.
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Ensaio imunorradiometrico para a determinacao de proteinas bacterianas contaminantes em lotes de hormomio de crescimento humano recombinante produzido no IPEN-CNEN/SP.
1995.
Dissertacao (Mestrado) -
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP,
Sao Paulo.
83 p.
Orientador: Paolo Bartolini.
Palavras-Chave: escherichia coli; experimental data; immune serums; iodine 125; labelling; purification; rabbits; radioimmunoassay; recombinant dna; sth
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IPEN-DOC 14044
- PEREIRA, MARCO A. dos S.
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Estudo da acao da radiacao gama de sup(60)Co sobre Salmonella poona, Escherichia coli e Alicyclobacillus Acidoterrestris em polpa de manga congelada
/ Study of the action of 60Co gamma radiation on Salmonella poona, Escherichia coli and Alicyclobacillus acidoterrestris in mango pulp
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2009.
Tese (Doutoramento) -
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP,
Sao Paulo.
93 p.
Orientador: Nelida Lucia Del Mastro.
DOI:
10.11606/T.85.2009.tde-27102009-100426
Abstract: A aplicação de tratamentos não-térmicos têm se mostrado eficiente na inibição de bactérias como Salmonella spp e Escherichia coli. A manga é uma fruta de consumo nacional que possui grande potencial de exportação. Entretanto, surtos de doenças transmitidas por alimentos relacionados a essa fruta provocaram desconfiança sobre o grau de segurança alimentar oferecido pelo produto. O objetivo deste trabalho foi determinar a radiorresistência das bactérias Escherichia coli, Salmonella poona e Alicyclobacillus acidoterrestris na polpa de manga através do cálculo do valor D10 e conhecer o efeito da radiação gama sobre as características organolépticas de polpa de manga. Foi também estabelecido o perfil microbiológico de polpas de manga congeladas disponíveis no mercado utilizando métodos convencionais de plaqueamento e Número Mais Provável (NMP). As polpas contaminadas experimentalmente com as bactérias citadas acima foram irradiadas com doses de 0, 1, 2, 3, 4 e 5 kGy, em fonte de 60Co. A análise sensorial foi feita utilizando dose de 5 kGy, aplicando o teste triangular e o teste de aceitação com escala hedônica. Os resultados deste trabalho mostram que a qualidade das polpas de manga comercializadas não é satisfatória de acordo com os padrões estabelecidos pela lei brasileira e pela literatura, mostrando a necessidade da implantação de outras ferramentas para se alcançar níveis de qualidade aceitáveis. Os valores de D10 obtidos se situaram entre 1,01 e 1,09kGy para E. coli ATCC 8739, entre 0,6 e 0,98kGy para S. poona e entre 0,72 e 0,88kGy para A. acidoterrestris respectivamente. A análise sensorial mostrou que a dose de 5kGy alterou as características sensoriais da polpa de manga. Entretanto, quando a polpa irradiada foi utilizada como ingrediente, o produto obteve boa aceitação nos atributos de aparência geral, sabor e aroma.
Palavras-Chave: food processing; fruits; mangoes; market; brazil; gamma radiation; cobalt 60; radiation doses; radiation effects; radiosensitivity; sensors; salmonella; escherichia coli; bacteria; food industry
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A elaboração do projeto do RI do IPEN foi iniciado em novembro de 2013, colocado em operação interna em julho de 2014 e disponibilizado na Internet em junho de 2015. Utiliza o software livre Dspace, desenvolvido pelo Massachusetts Institute of Technology (MIT). Para descrição dos metadados adota o padrão Dublin Core. É compatível com o Protocolo de Arquivos Abertos (OAI) permitindo interoperabilidade com repositórios de âmbito nacional e internacional.
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